作物維管束病害是影響農業生産和糧食安全最為嚴重的病害類型之一，危害程度大防治特别困難，如水稻白葉枯病、作物細菌性青枯病和柑橘黃龍病等。相關病原菌水稻白葉枯病菌和青枯菌侵染植物的維管系統，能夠占據并阻斷木質部維管束從而影響植物的水分和營養物質運輸，最終造成植物萎蔫死亡。生物膜是細菌抵禦惡劣生存環境、抗菌物質或宿主免疫反應的重要策略，然而以青枯菌為代表的植物病原細菌如何調控生物膜在宿主内的動态變化，幫助細菌在維管束中定殖和擴展傳播的機制還不清楚。

近日，我校植物病害綠色防控團隊李博教授課題組在國際權威期刊Nature Plants上發表了題為“Holliday junction resolvase RuvC targets biofilm eDNA and confers plant resistance to vascular pathogens”的研究論文，揭示了青枯菌如何利用霍利迪連接體解離酶RuvC促進成熟的生物膜解離和細菌擴散的分子機制，并且通過靶向生物膜形成創制了對青枯菌具有廣譜抗性的番茄新種質，相關抗病改良策略在水稻白葉枯病中也得到了驗證。本項研究為發掘和創制抗維管束病害資源提供了新思路，為培育持久抗病品種提供了有應用價值的新資源。

通過蛋白組學質譜分析青枯菌GMI1000生物膜蛋白質組，鑒定到高豐度霍利迪結構Holliday junction (HJ)解離酶RuvC。在青枯菌中敲除RuvC影響對番茄緻病力和抑制了青枯菌在木質部内的擴散和遷移。分析發現敲除突變體導緻生物膜和eDNA過度積累，同時eDNA的網格狀結構在RuvC突變體中明顯加強，證明了RuvC負調節青枯菌生物膜eDNA形成。為了解析RuvC作用于eDNA的功能機制，研究發現RuvC能夠分泌到細菌胞外，并且和生物膜eDNA類霍利迪結構有共定位，體外酶學活性實驗證明了RuvC能夠降解具有十字形結構的DNA，并證明其解離酶活性是青枯菌毒力所必須的。在體外生物膜培養系統中添加RuvC重組蛋白可以顯著抑制青枯菌生物膜的形成，通過檢測青枯菌RuvC在體外和番茄木質部内的表達動态，發現RuvC在生物膜成熟後期受誘導表達。綜合以上研究結果提出了青枯菌生物膜動态的調控模型：在定殖早期青枯菌形成生物膜占據生态空間并進行繁殖，在生物成熟後營養和空間不足，細菌分泌RuvC降解eDNA的類霍利迪結構，使部分生物膜解體促進細菌擴散和侵染。

                                                                              圖2 青枯菌RuvC調控生物膜動态變化的工作模型

基于HJ結構解離酶對青枯菌生物膜的調控功能，研究團隊創新性地設計了利用病原菌自身核酸酶靶向生物膜提高作物抗病性的思路，創制了一系列廣譜抗作物維管束細菌病害的新型種質材料。将植物病程相關蛋白PR1的分泌信号肽與青枯菌RuvC蛋白融合表達，轉化獲得表達該分泌蛋白的番茄和煙草，發現轉基因材料提高了茄科作物不同青枯菌菌株的抗病性，青枯菌侵染後的番茄和煙草存活率提高約50%。此外在水稻Nipponbare背景中表達具有信号肽的水稻黃單胞菌同源蛋白XooRuvC，發現轉基因水稻對白葉枯病的抗病性顯著提高。

此外，通過系統發育分析發現具有RuvC樣功能域的蛋白MOC1在植物中普遍存在，該蛋白定位于葉綠體中。體外表達純化番茄和水稻不含葉綠體轉運肽的MOC1重組蛋白，對青枯菌和白葉枯菌的生物膜都有較強的抑制作用，而且在番茄毛根中表達分泌型SlMOC1後明顯提升番茄對青枯菌的抗性。以上研究結果表明将細菌或植物來源的HJ結構解離酶表達并分泌到植物胞外，可以有效地提高作物對細菌維管束病害的抗性，證明了靶向細菌生物膜是一種作物抗病改良的新思路。

圖3 在植物中表達霍利迪解離酶提高作物對維管束病害的抗病性

該項研究不僅在理論上揭示了青枯菌生物膜動态調控和細菌在木質部中擴散的新機制，闡明了青枯菌利用霍利迪結構解離酶促進生物膜解體、幫助細菌擴散侵染的分子機理，而且提出了靶向細菌生物膜提高作物抗病能力的新理念，成功創制了茄科和水稻抗維管束細菌病害的新材料，對于認知病原細菌生物膜的緻病機理和作物維管束細菌病害的綠色防控均具有重要意義。

我校農業微生物資源發掘與利用全國重點實驗室、湖北洪山實驗室在讀博士生杜鑫雅為論文第一作者，李博教授為論文的通訊作者，植物病害綠色防控團隊姜道宏教授、付豔蘋教授、程家森教授、謝甲濤教授、于曉教授和Kenichi Tsuda教授等參與了該項研究，生命科學技術學院袁猛教授、殷平教授和闫俊傑研究員為相關研究提供實驗材料和技術指導。本研究得到國家重點研發計劃、國家自然科學基金和中央高校基本科研業務費等項目的資助。